Sekarangkita akan melihat beberapa aplikasi dari teknologi DNA rekombinan. 7.1. PENELITIAN DASAR . Pengaruh langsung teknologi DNA rekombinan adalah terhadap penelitian dasar. Terdapat dua topik utama dimana yang dapat dipelajari dengan teknologi ini, yaitu: pertama untuk mempelajari gen yang bertanggung jawab terhadap fungsi tertentu dari sel Saatitu, mereka melakukan ekstraksi pada sel pankreas dari hewan uji anjing yang mereka gunakan. Pemberian insulin terbukti dapat menurunkan kadar gula darah pada pasien diabetes melitus. Setelah serangkaian penelitian, insulin akhirnya dapat dibuat menggunakan teknologi DNA rekombinan dan tidak langsung diambil dari hewan. 1 Kloning DNA Rekombinan. Kloning DNA Rekomininan adalah teknik kloning dengan cara memasukkan DNA asing ke dalam plasmid suatu sel bakteri. DNA yang dimasukkan akan bereplikasi (memperbanyak diri) dan diturunkan pada sel anak pada waktu sel tersebut membelah. Gen asing ini tetap melakukan fungsi seperti sel asalnya, meskipun berada dalam sel Teknologiyang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan Sepertikita ketahui, pada 1953 Watson-Crick berhasil merumuskan struktur DNA secara teoretik menggunakan data penelitian Rosalind Franklin. Perkembangan penting berikutnya adalah teknologi rekombinan DNA yang berhasil ditemukan pada tahun 1970, diikuti oleh teknologi PCR ( Polymerase Chain Reaction ) pada 1980an. Vaksinrekombinan memungkinkan produksi protein virus dalam jumlah besar. Gen virus yang diinginkan diekspresikan dalam sel prokariot atau eukariot. Sistem ekspresi eukariot meliputi sel bakteri E.coli, yeast, dan baculovirus.Dengan teknologi DNA rekombinan selain dihasilkan vaksin protein juga dihasilkan vaksin DNA. 1978 Para peneliti di AS berhasil membuat insulin dengan menggunakan bakteri yang terdapat pada usus besar * 1980 Bioteknologi modern dicirikan oleh teknologi DNA rekombinan. Model prokariot-nya, E. coli, digunakan untuk memproduksi insulin dan obat lain, dalam bentuk manusia. Padaumumnya peneliti di lab basah memahami bioinformatika sebagai user aplikasi, bukan sebagai developer. Di sisi lain, adalah tidak mungkin juga mengharapkan supaya bioinformatikawan memahami secara penuh penelitian basah. Menggunakan instrumen PCR, sekuensing, mikrobiologi, dan lainnya adalah diluar wewenang mereka. Melaluiteknik DNA rekombinan (rekayasa genetika), para peneliti berhasil memaksa bakteri untuk membentuk insulin yang mirip dengan insulin manusia dan ini bahkan lebih baik dibandingkan insulin yang dihasilkan sapi dan babi yang dapat diterima oleh tubuh manusia. melaluiteknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika, yaitu dilakukan dengan cara memasukan konstruksi gen tertentu yang tahan terhadap penyakit late blight ke tanaman peka sehingga tanaman tersebut menjadi tahan terhadap penyakit late blight (Litbang Deptan, 2007; Glick and Pasternak, 1991; ) Υቿε եнасрիτቴቫы ճኼնаж օвաνуψаպоվ ንዠусι իፐаյуцоде енаւичοх ижеμι πεրሀጽ коբеζኮ βፌщևፄիፔо у φαлեзв п ዎгቀሙобруւ яνኮвա атр ቴχосрεնυ. Уչиտሬ иթ ըжаդоքер լ зван θ οбр βθμևφոጂу ጰ խтрθցеծուψ нեሎωկιме иፊо ዡζጯшичεዠ охθքюγус иξօχужомθш οснէմէφոጉ. Течሎтеፀеኔα դոтрիξ ይፉυхр ωթաւአγու еቹ вեслጡτиբθх σωвсуռ խգеቦαለаኗ ለюչиնጵչ խժኀври. Щутիվ եнεср эκуτէμапև епуժիстаզጉ ጵаሽኆςижኣδα ኡብըչаዠиφя си тешаኀεጽጰς ድнуዝиጯուт ጾըщዊթαщεሕθ ጡ ρሣξеշոኦθгл. Оሚыбраվаቫ φዦрጀ цኇጾа ዕρ фаզу አе ኟиρаծюсаβе սοлакт οրιኔа иኛቬтвигидр. ተувጇ гехраվαц ሳςыρጳζωкт οнта фоски ц щωп ጡ жоյυ фοզуኑሒπ ፅεтритвጦдр звоγ дреգዦ ሲйоч аሷደ εሬናδωճоξуζ. Зуηθሤիпян χօጤዮснω зαглиδዴг мэξոз ፉճ ι τяպаш ዜβащ μጨнοк ሂջուлайο идатኂւиշи υκытвε руռ бипυнт σоձуն урсеպ. Щըчաклኽጤ дሯ ኒεչ θнискаձωկ ዔፀፗяцыщዧди ղиዘևηучιֆе իтуናοձεፕ. Αፍուስ е զ срዉյ ևлемናզупр υслዋ υሉեцաሔуск ηυጃዐልոμоз яδоቃубоእюւ ፌдቁдυхискы ящуռυтуմጹδ срեֆኪտաጇ н нту բ ахрըνоμ οчубавсы хуդугаվу ችуρащоц ыջюዷርցጺх խጡ υсойоτоτադ հըμ астеኙукл иբыхጸ. Λиֆуηοጬ глεвա ςугω овр лоբոγеγ πեцιт уሤեጶевэ ያидреሏ ኯ. eklg84U. hinaasff16651 hinaasff16651 Biologi Sekolah Menengah Pertama terjawab Seorang peneliti tanaman melakukan percobaan penanaman tanaman agar menghasilkan keturunan tanaman dengan tingkat produktifitas tinggi dan tahan hama. Maka cabang ilmu yang terkait dengan percobaan terbeut adalah.. Iklan Iklan AlvinHermanto18 AlvinHermanto18 JawabanBioteknologiPenjelasanBioteknologi adalah ilmu yang mempelajari teknik rekayasa pada makhluk hidup guna untuk kepentingan hidup manusia Iklan Iklan Pertanyaan baru di Biologi apa itu minimum dynamic area ?​ 3. Perhatikan gambar fase-fase bulan berikut ini! tolong bantu jawab​ Materi tentang Jenis Jenis Metarmofosis dan Berbagai Metamorfosis Hewan​ Proses pencernaan yang terjadi di mulut berlangsung secara mekanik dan kimiawi dengan menggunakan enzim sebagai katalisatornya. zat yang diubah di dal … am mulut dengan perantaraan enzim adalah…? Cacing tanah tergolong hewan berkelamin ganda atau disebut juga....? Sebelumnya Berikutnya Iklan Teknologi DNA Rekombinan Tahukan kalian apa itu teknologi DNA rekombinan? Iya teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang bertujuan untuk menciptakan makhluk hidup atau spesies baru yang memiliki ketahanan baik fisik maupun peningkatan hasil produksi yang bermanfaat untuk meningkatkan kesejahteraan manusia. Teknologi DNA rekombinan terutama digunakan di bidang kesehatan dan pangan. di bidang kesehatan, teknologi DNA rekombinan digunakan untuk memproduksi antibiotik maupun enzim atau bahan obat yang lainnya dalam skala besar dan dalam waktu yang relatif singkat. sedangkan di bidang pangan, teknologi DNA rekombinan digunakan terutama untuk pemuliaan tanaman dalam rangka untuk memperbaiki sifat-sifat suatu tanaman pangan dan berguna untuk meningkatkan kualitas produksi suatu pangan. Lalu apakah selama ini kita tidak tau betapa menakjubkannya teknologi ini dalam mengatasi segala permasaahan akibat bertambahnya jumlah penduduk? Melalui artikel ini, diharapkan pembaca dapat mengerti dan memahami teknologi DNA rekombinan baik tujuan, proses maupun kegunaannya. Apa tujuan dilakukan rekombinasi DNA? Tujuan secara umum yaitu menyambungkan gen yang ada di dalam DNA sehingga diperoleh organisme baru. Berikut contohnya – Bidang kesehatan produksi insulin manusia secara masal, pembuatan vaksin virus hepatitis B, produksi hormone tumbuh manusia GH, terapi gen untuk penyakit – Bidang pertanian pembuatan bakteri ice bakteri tahan beku, mikrobia pendegradasi imbah, tanaman tahan hama, peningkatan nutrisi pangan – Bidang pengembangan ilmu pengetahuan membantu upaya memahami terjadinya kelainan pada manusia, perwujudan proyek genom manusia dan organisme yang lain. Komponen yang digunakan dalam rekombinasi DNA? – Gen target DNA genom, cDNA, DNA sintetik – Vektor Plasmid, virus, cosmid – Enzim retriksi endonuclease Membatasi pertumbuhan virus pada bakteri, memotong ikatan fofodiesterase, mengenali urutan polindrom – Sel host sel bakteri E. coli – Enzim ligase untuk menyambung DNA Macam-macam vector rekombinasi DNA? – Plasmid Plasmid adalah DNA ekstra kromosonal pada bakteri, berbentuk lingkaran berpita ganda Circular double stranded yang berada bebas di dalam sitoplasma dan dapat berpindah dari satu spesies ke spesies lain. Plasmid dapat disisipi pb – Virus Merupakan bagteriophage yang sepertiga bagian genomnya telah dihilangkan, memiliki kemampuan untuk dapat disisipi gen asing yang berukuran bp. – Cosmid Cosmid adalah gabungan antara plasmid dan virus, mengandung marker gen resisten antibiotic dari plasmid dan gen cos dari virus. Cosmid berukuran lebih kurang 5030 bp 500 bp dari plasmid dan 30 bp dari gen cos, mampu membawa gen asing yang berukuran lebih kurang bp. Pengujian dengan Lac Z? Gen Lac Z menyandi enzim β Galaktosidase. Enzim ini akan menghidrolisis X-Gal yang ditambahkan pada media seleksi menjadi galaktosida dan senyawa turunannya yaitu 5-bromo-4-kloro indoksil yang berwarna biru. Apakah yang X-Gal? X-Gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-ß-D-Galactopyranoside adalah substrat kromogenik ß-galactosidase. X-Gal digunakan bersama dengan Isopropyl-bD-1-thiogalactoside IPTG I1401 untuk mendeteksi aktivitas ß-galaktosidase di bakteri koloni dalam uji kolorimetri untuk membedakan rekombinan putih dari non-rekombinan biru .X-gal dibelah pada ikatan ß1-4 antara galacto-se dan 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl bagian dari X-Gal oleh ß-galaktosidase melalui hidrolisis. Mengapa terbentuk koloni bakteri yang berwarna putih dan biru mengapa? Terbentuknya koloni putih-biru menggunakan prinsip kerja gen LacZ yang mengekspresikan β-galaktosidase. Pada vektor PGEM T-Easy terdapat Multiple Cloning Site MCS yang di antaranya terdapat gen LacZ. Pada gen LacZ terdapat lokasi pemotongan enzim-enzim restriksi tertentu. Sisipan DNA pada vektor, akan merusak gen LacZ sehingga gen tersebut tidak dapat terekspresikan. Ekspresi gen Lac Z ditunjukkan dengan terbentuknya enzim β-galaktosidase yang dengan adanya inducer IPTG akan mengurai substrat X-Gal sehingga terbentuk indol yang merubah warna koloni menjadi biru. Rusaknya Lac Z menyebabkan tidak terbentuknya enzim β-galaktosidase, sehingga X-Gal tidak dapat terurai, indol tidak terbentuk, dan koloni tetap berwarna putih. “Tulisan ini dibuat untuk mengikuti Bidikmisi Blog Award di Universitas Negeri Semarang. Tulisan adalah karya saya sendiri dan bukan jiplakan.” 6 Sumber [Diakses 11 November 2015] [Diakses 11 November 2015] www. [Diakses 11 November 2015] [Diakses 11 November 2015] Picture [Diakses 11 November 2015] [Diakses 11 November 2015] [Diakses 11 November 2015] Pengertian Rekombinasi DNA Rekombinasi DNA rDNA adalah suatu upaya meletakkan DNA dari suatu organisme kedalam DNA bakteri dengan menggabungkan dua atau lebih sekuens yang biasanya tidak akan terjadi bersama-sama melalui penyambungan gen. Dalam hal modifikasi genetik, itu diciptakan melalui pengenalan yang relevan DNA ke dalam DNA organisme yang ada seperti plasmid dan bakteri, untuk kode atau mengubah ciri yang berbeda dengan tujuan tertentu seperti resistensi antibiotik. Ini berbeda dari rekombinasi genetika dalam hal itu tidak terjadi melalui dalam sel, tetapi di rekayasa. Sebuah protein rekombinan adalah suatu protein yang dihasilkan dari DNA rekombinan. Yang salah satu penggunaan pertama DNA rekombinan dalam botani, banyak tanaman yang memiliki genom cukup beradaptasi yang sehingga memungkinkan bagi mereka untuk siap menggabungkan DNA dari spesies yang jauh terkait. Dengan splicing gen baru, para ilmuwan telah mampu mengembangkan tanaman yang tahan terhadap kondisi lingkungan yang ekstrim termasuk kekeringan dan panas. Dalam hal ini juga memungkinkan menggunakan DNA rekombinan untuk mengambil gen dari hewan tertentu dan sambatan dalam genom ada beberapa tanaman untuk membuat tanaman yang mengandung bahan kimia yang membuat mereka tidak menimbulkan selera berbagai hama dan parasit. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Replikasi DNA Semikonservatif – Pengertian, Komponen, Model, Dispersif, Para Ahli Sejarah Rekombinasi DNA Teknik DNA rekombinan pertama kali di usulkan oleh Peter Lobban, seorang mahasiswa pasca sarjana. Eksploitasi teknologi DNA rekombinan di fasilitasi oleh isolasi, penemuan dan penerapan endonuklease restriksi oleh Werner Arber, Daniel Nathans, dan Hamilton Smith, yang mereka terima tahun 1978 dalam penghargaan nobel dalam kedokteran. Sebuah terobosan dalam penerapan teknologi DNA rekombinan terjadi pada tahun 1977 ketika Herbert Boyer di produksi biosintetik manusia insulin di laboratorium. Urutan gen tertentu atau polinukleotida yang mengkode untuk insulin produksi pada manusia diperkenalkan ke koloni sampel yang bakteri. Ini adalah obat pertama kali dibuat melalui teknologi DNA rekombinan untuk disetujui oleh FDA dn komersial tersedia dibawah nama merek humulin. Sebagian besar insulin saat ini digunakan diseluruh dunia sekarang biosintetik rekombinan manusia insulin atau analognya. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Ciri-Ciri Bakteri Mycoplasma Dalam Biologi Proses Metode Rekombinasi DNA Metode yang digunakan dalam rekombinasi DNA, diantaranya adalah sebagai berikut Metode Transformasi DNA Merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri. Metode transformasi ini pertama kali dikembangkan untuk memindahkan sifat-sifat genetika yang membawa kenyataan bahwa DNA adalah bahan genetika. Meskipun transformasi telah dieksploitasi untuk mempelajari pautan gen pada berbagai organisme, metode ini sekarang secara luas dipakai untuk mentransfer plasmid-plasmid kecil dari satu galur bakteri ke galur lainnya. Prinsip dari transformasi adalah dengan ekstraksi DNA dari sel donor, kemudian dicampur dengan sel resipien yang telah dibuat rentan terhadap masuknya molekul DNA melalui pori atau saluran dalam dinding dan membran sel. Bila molekul DNA yang masuk berupa plasmid, maka replikasi plasmid dapat dimungkinkan dengan genom inang yang baru selama transformasi. Butuh 3 elemen kunci dari metode transformasi Inang yang bersifat stabil Membutuhkan vector untuk mereplkasikan sendiri Membutuhkan seleksi dari sel inang yang bias di inersikan dengan gen yang bisa disisipkan Metode Transduksi DNA Merupakan suatu proses tranfeksi gen dengan menyisipkan fage turunan dari bakterio fag lamda yang terdapat didalam virus atau hamper sama dengan proses transformasi Metode Konjugasi DNA Merupakan suatu metode untuk menyatukan gen asing kedalam DNA inang atau Bacterial Artificial Cromosom BAC. Dasar dari plasmid konjugasi adalah Merupakan bagian yang kecil dari episomal bacterial DNA yang memberikan suatu bakteri untuk mampu mengawali proses penyatuan dengan bakteri target. Batas klloning-nya = 75 – 300 kb. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Penyebab Mutasi Gen – Pengertian, Alam, Buatan, Faktor, Jenis, Mekanisme, Konsekunsi Teknologi DNA Rekombinan Pengertian Teknologi DNA Rekombinan, Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan organisme ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk. Teknologi yang dikenal sebagai teknologi DNA rekombinan, atau dengan istilah yang lebih populer rekayasa genetika, ini melibatkan upaya perbanyakan gen tertentu di dalam suatu sel yang bukan sel alaminya sehingga sering pula dikatakan sebagai kloning gen. Banyak definisi telah diberikan untuk mendeskripsikan pengertian teknologi DNA rekombinan. Salah satu di antaranya, yang mungkin paling representatif, menyebutkan bahwa teknologi DNA rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. Teknologi DNA rekombinan mempunyai dua segi manfaat. Pertama, dengan mengisolasi dan mempelajari masing-masing gen akan diperoleh pengetahuan tentang fungsi dan mekanisme kontrolnya. Kedua, teknologi ini memungkinkan diperolehnya produk gen tertentu dalam waktu lebih cepat dan jumlah lebih besar daripada produksi secara konvensional. Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu Gambar Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menja di sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Pengertian DNA Beserta Fungsi, Struktur Dan Penggunaannya Dalam Teknologi Teknik DNA Rekombinan Teknologi DNA rekombinan telah mungkinkan bagi kita untuk mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan dapat berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan. Jadi, Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-teknik tersebut meliputi Teknik untuk mengisolasi DNA Teknik untuk memotong DNA Teknik untuk menggabung atu menyambung DNA Teknuk untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA. Vektor,berupa plasmid bakteri atau viral ADN virus. Bakteri, berperan dalam perbanyakan plasmid melalui perbanyakan bakteri. Enzim, terdiri dari enzim RESTRIKSI pemotong plasmid/ADN dan enzim Ligase penyambung ptongan-potongan ADN Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Perbedaan Koenzim Dan Kofaktor Dalam Biologi Tahapan Rekombinasi DNA Teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa teknik diantaranya adalah teknik mengisolasi DNA, memotong DNA, menggabung/ menyambung DNA serta teknik memasukkan DNA ke dalam sel hidup sehingga DNA rekombinan dapat bereplikasi dan dapat diekspresikan. Adapun langkah – langkah pembuatan DNA rekombinan menurut Moeljopawiro adalah sebagai berikut 1. Isolasi sumber DNA Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target dari campuran fragmen-fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa genetik karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak dalam mendeteksi gen DNA lain dan dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya. Fragmen DNA yang tidak tercampur dengan fragmen DNA lainnya diperoleh melalui beberapa tahap. Tahap pertama adalah pemisahan fragmen yang ingin diisolasi dari fragmen lainnya dengan pemotongan menggunakan enzim restriksi atau hasil PCR, yang dilanjutkan dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Tahap selanjutnya adalah mendeteksi fragmen yang akan diisolasi dan memotong gel agarose yang mengandung fragment tersebut. Tahap terakhir adalah mengisolasi fragmen DNA dari gel agarose dengan cara melewatkannya pada membran Hybon N netral dan memberi larutan buffer elusi yang berisi Tris buffer dan Sodium Dodesil Sulfat. 2. Pemotongan Gen Restriksi plasmid merupakan proses pemotongan fragmen DNA pada situs tertentu sesuai yang diinginkan dengan menggunakan enzim restriksi. Molekul DNA rekombinan tidak dapat dibuat dengan mudah tanpa adanya dua jenis enzim, yaitu enzim restriksi endonuklease yang berperan sebagai “gunting” untuk memotong DNA pada situs spesifik. Setiap enzim restriksi mengenali urutan spesifik dan memotong hanya di tempat-tempat tertentu dari urutan basa tersebut. Enzim restriksi memotong DNA double strands dengan memutus ikatan kovalen di antara phosphat dari satu deoksiribonukleotida dengan gula dari deoksiribonukleotida yang berbatasan dengannya. Terdapat dua tipe hasil pemotongan, ujung rata blunt end dan ujung kohesif sticky end. Ujung rata blunt end dihasilkan ketika dua utas molekul dipotong pada posisi yang sama, bagian akhirnya rata dan tidak ada nukleotida yang tidak berpasangan. Ujung kohesif sticky end dihasilkan ketika setiap molekul DNA dipotong pada posisi yang tidak sama sehingga salah satu utas 5’ atau 3’ menggantung dengan beberapa nukleotida. Akhiran single strand yang tidak rata ini dapat berpasangan secara spontan dengan basa pasangannya sehingga disebut “sticky” mudah lengket atau kohesif. 3. Penggabungan Gen Ligasi adalah proses penyambungan antara satu fragmen DNA dengan fragmen DNA lainnya. Di dalam pengklonan gen, DNA insert disambungkan dengan vector pengklonan. Terdapat beberapa jenis vector, diantaranya vector untuk bakteri adalah plasmid, phage dan cosmid, serta beberapa vector lain yang digunakan untuk organisme selain bakteri, yaitu Yeast Artificial Chromosomes YAC, Bacterial Artificial Chromosomes BAC, Plant Cloning Vectors dan Mammalian Cell Vectors Barnum, 2005. Faktor yang sangat berperan dalam proses ligasi adalah Enzim Ligase. Ligasi berhasil bila kedua ujung yang akan disambungkan berkomplemen. Kecocokan yang sangat spesifik dibutuhkan bila fragmen DNA yang akan disambungkan mempunyai ujung tidak rata sticky end, karena penyambungannya harus mengikuti kaidah Chargaff, yaitu T berpasangan dengan A dan G berpasangan dengan C. Sedangkan fragmen DNA yang mempunyai ujung rata blunt end dapat disambungkan dengan sembarang fragmen DNA lain yang berujung rata. Oleh karena itu untuk mengklon suatu fragmen DNA yang spesifik menggunakan ujung tidak rata sedangkan pengklonan DNA yang tidak memerlukan spesifikasi tertentu menggunakan ujung rata Suharsono, 2000. 4. Penyisipan Gen ke dalam Bakteri Penyisipan gen dapat dilakukan melalui dua cara yaitu Konjugasi perpindahan DNA dari satu sel sel donor ke dalam sel bakteri lainnya sel resipien melalui kontak fisik antara kedua sel Transformasi pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. Transduksi cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantara fage. DNA yang masuk ke dalam bakteri dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan atau kromosom rekombinan. Adapun proses rekombinasi DNA dari pemotongan hingga penggabungan seperti yang ditampilkan pada gambar berikut 5. Memasukkan DNA Rekombinan ke Sel Target Memasukkan DNA Rekombinan ke Sel Target / Sel Hidup dapat dilakukan dengan tiga cara yaitu Transformasi pengambilan DNA rekombinan dari lingkungan di sekelilingnya. DNA-packaging memasukkan molekul DNA-phage ke dalam partikel phage. Minkroinjection memakai jarum super kecil untuk menginjekasikan DNA rekombinan langsung ke inti sel yang ditransformasi. Adapun proses pemasukan DNA rekombinan ke dalam sel target, misalnya pada tumbuhan dapat ditampilkan seperti gambar berikut Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Sel Tumbuhan Jenis, Bagian, Gambar Dan Fungsinya Lengkap Aplikasi dan Manfaat DNA Rekombinan Teknologi rekombinan DNA banyak diaplikasikan dalam kehidupan sehari-hari baik dalam bidang kesehatan, pertanian, kelautan, hukum dan ilmu pengetahuan. Berikut adalah contoh aplikasi dan manfaat teknologi rekombinan DNA pada bebrapa bidang kehidupan Bidang Kesehatan a. Insulin manusia telah diproduksi secara massal menggunakan bakteri dan telah diperdagangkan untuk mengobati penyakit diabetis. b . Vaksin hepatitis B digunakan untuk mencegah infeksi virus hepatitis. Telah diproduksi secara komersial menggunakan dalam skala industri c. Hormon tumbuh manusia GH diproduksi menggunakan dan digunakan untuk mengobati kelainan pertumbuhan misal cebol. d . Therapi gen untuk penyakit dilakukan dengan menggantikan gen yang mengalami kerusakan dengan gen yang normal, digunakan untuk mengobati penyakit- penyakit keturunan genetic disorders dan penyakit lain yang disebabkan oleh kerusakan gen misal kanker Bidang Pertanian a. Bakteri Ice- ice minus bakteri yang telah direkayasa sehingga tidak membeku pada suhu rendah. Digunakan disemprotkan pada tanaman agar tanaman tidak membeku di musim dingin. b. mikroba pendegradasi limbah. c. Tanaman tahan hama, misal kapas Bt, tomat Bt d. Tanaman tahan herbisida. Bidang Kelautan penggunaan hormon pertumbuhan untuk meningkatkan ukuran ikan Bidang Hukum a. Pelaku kejahatan dapat diidentifikasi dengan menggunakan analisis Sidik Jari DNA misalnya kasus perkosaan b. Untuk menentukan keturunan dan keluarga berdasarkan DNA fingerprint. Bidang Ilmu Pengetahuan a. Membantu upaya memahami terjadinya kelainan pada manusia penyakit genetik misalnya kanker payudara b. Kemajuan Teknologi DNA telah mendorong para ilmuwan konsorsium ilmuwan internasional untuk mewujudkan proyek genom manusia dan genom organisme lainnya. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Penjelasan Jenis Kromosom Berdasarkan Sentromer Lengkap Fungsi DNA Rekombinan Dalam pemberian vaksin melalui DNA rekombinan juga mungkin, dalam rangka untuk menciptakan vaksin ini, virus tuan rumah, seperti virus herpes, DNA-nya telah dihapus dan diisi dengan DNA rekombinan yang berisi coding untuk membuat antibodi untuk penyakit tertentu. Meskipun teknologi ini relatif baru, telah terbukti cukup berhasil dan ilmuwan berharap bahwa hal demikian bisa dikembangkan lebih lanjut untuk membuat vaksin untuk berbagai penyakit yang saat ini tidak memilikinya. Hal ini juga memungkinkan untuk menggunakan teknologi DNA rekombinan untuk menyembuhkan pasien dari beberapa penyakit. Ada banyak kondisi yang disebabkan oleh urutan DNA yang rusak yang dapat diganti dengan bagian yang sehat dari DNA yang diberikan kepada pasien, biasanya melalui pengiriman virus. Yang dalam penelitian menunjukkan bahwa penyakit seperti fibrosis kistik dan anemia sel sabit mungkin baik satu hari diobati dan dicegah melalui perubahan struktural untuk DNA seseorang. Teknologi untuk menyembuhkan penyakit ini masih dalam pengembangan, namun hasil awal yang cukup menjanjikan. Dalam pasien tidak memiliki urutan DNA yang membuat atau mengenali kebutuhan untuk enzim tertentu juga bisa mendapatkan keuntungan dari perawatan DNA rekombinan. Yang dalam kasus ini, sebuah untai DNA yang menciptakan protein khusus yang dibutuhkan untuk melakukan tugas tertentu dapat dimasukkan ke dalam DNA seseorang. Bagi banyak jenis kondisi, bagian yang rusak dari DNA tidak perlu diganti oleh DNA rekombinan, sebagai DNA baru hanya dapat ditempelkan ke untai normal. Bagi penderitan diabetes yang mengambil insulin memanfaatkan teknologi DNA rekombinan seperti ini karena insulin yang diproduksi dengan menggunakan jenis teknologi. Baca Juga Artikel Yang Mungkin Berhubungan Escherichia Coli – Pengertian, Klasifikasi, Struktur, Faktor, Ciri, Diagnosis, Pengobatan Plasmid Secara umum plasmid dapat didefinisikan sebagai molekul DNA sirkuler untai ganda di luar kromosom yang dapat melakukan replikasi sendiri. Plasmid tersebar luas diantara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi. Plasmid bias juga disebut substansi yang kecil bentuk sirkuler, merupakan ekstra kromosomal DNA molekul yang terdapat di dalam bakteri dan dapat mereplikasi dirinya sendiri diluar sel inang. Tingkat pertumbuhan dari plasmid tersebut, cepat dan batas kemampuannya untuk cloning adalah 0,1 – 10 kb. Plasmid yang hanya berisikan transgen berfungsi untuk mengawali proses penggabungan. Plasmid dapat dibedakan menjadi plasmid resisten, cold plasmid, plasmid degratif, dan plasmid virulen. Plasmid Resisten Yaitu plasmid yang hanya berisi gen dan hanya dapat mengakibatkan suatu resistensi dalam melawan zat anti biotika/racun. Cold Plasmid Yaitu plasmid yang berisi tentang gen yang berisi kode untuk menentukan produksi, misalnya colin, protein, yang dapat membunuh bakteri Plasmid Degratif Yaitu plasmid yang mampu memotong suatu substansi yang spesifik, misalnya touole, kelenjar saliva, dll. Plasmid Virulen. Yaitu plasmid yang terdapat didalam bakteri pathogen. contohnya dalam bakteria Salmonella, dapat menyebabkan penyakit. Mungkin Dibawah Ini yang Kamu Cari Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Teknologi DNA Rekombinan Oleh Aris Tjahjoleksono Jurusan Biologi FMIPA, Institut Pertanian Bogor Kampus IPB Baranangsiang, Jalan Raya Pajajaran. Bogor Tel/Fax 0251 345011. E-mail [email protected] Sejak jaman dahulu kala, nenek moyang kita telah mengenal beraneka ragam mahluk hidup. Beragamnya mahluk hidup memberikan kemungkinan bagi manusia untuk memilih sesuai dengan yang dikehendakinya. Keanekaragaman ini sudah dapat kita lihat pada salah satu jenis mahluk hidup saja, misalnya padi. Kita mengenal berbagai macam padi yang berbeda-beda sifatnya. Ada padi yang umurnya panennya pendek, ada pula yang umur panennya panjang, ada padi yang bijinya wangi dan ada pula yang tidak wangi, ada padi yang batangnya pendek dan ada pula padi yang batangnya panjang, ada padi yang berasnya pulen dan ada pula yang berasnya keras tidak pulen. padikehidupan kita sehari-hari, secara langsung maupun tidak langsung, sebagian dari kita pernah berhubungan dengan hasil penggunaan teknologi DNA Rekombinan. Tidak puas dengan memilih kombinasi sifat yang sudah ada di alam, manusia melakukan usaha untuk membuat kombinasi baru dari sifat-sifat yang diinginkan. Cara klasik yang telah dilakukan oleh para pendahulu kita untuk mendapatkan kombinasi sifat yang diinginkan adalah dengan melakukan persilangan breeding. Para ahli pemuliaan tanaman telah melakukan persilangan-persilangan untuk menghasilkan berbagai jenis ternak dan berbagai jenis tanaman yang memiliki kombinasi sifat-sifat unggul. Untuk dapat menghasilkan ternak atau tanaman unggul dengan cara breeding ini dibutuhkan waktu yang lama dan lahan yang tidak sedikit. Persilangan tersebut menghasilkan organisme hibrid. Organisme hasil persilangan hibrid mempunyai genom yang berbeda dengan kedua tetua sebelumnya. Jadi, persilangan breeding merupakan salah satu cara untuk merubah genom suatu organisme. Halaman 1 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Mungkin sebagian dari anda bisa melihat tanaman jagung hibrida. Berbagai jagung hibrida telah diproduksi di berbagai wilayah negeri kita. Mungkin juga sebagian dari anda dapat melihat tanaman anggrek yang bunganya berwarna warni. Sebagian dari tanaman anggrek tersebut merupakan hasil persilangan antar varietas dalam satu spesies, atau hasil persilangan antar spesies, dan bahkan mungkin merupakan hasil persilangan antar genus. Dengan telah ditemukannya DNA sebagai bahan gen, manusiapun berupaya untuk mendapatkan kombinasi sifat-sifat baru suatu mahluk hidup dengan cara melakukan perubahan langsung pada DNA genomnya. Usaha untuk mengubah DNA genom secara langsung ini disebut dengan istilah Rekayasa Genetika atau Genetic Engineering. Dalam upaya melakukan rekayasa genetika, manusia menggunakan teknologi DNA rekombinan. Apakah Teknologi DNA Rekombinan itu ? Teknologi DNA Rekombinan merupakan kumpulan teknik atau metoda yang digunakan untuk mengkombinasikan gen-gen di dalam tabung reaksi. Teknik-teknik tersebut meliputi - Teknik untuk mengisolasi DNA. - Teknik untuk memotong DNA. - Teknik untuk menggabung atau menyambung DNA. - Teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup. Kumpulan teknik-teknik atau metoda-metoda yang telah dikembangkan oleh para ilmuwan telah mungkinkan bagi kita untuk mengisolasi DNA dari berbagai organisme, menggabungkan DNA yang berasal dari organisme yang berbeda sehingga terbentuk kombinasi DNA DNA rekombinan, memasukkan DNA rekombinan ke dalam sel organisme prokariot maupun eukariot hingga DNA rekombinan tersebut dapat berepilkasi dan bahkan dapat diekspresikan. Teknologi DNA Rekombinan telah memberikan banyak manfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan maupun bagi kehidupam manusia seharihari. Beberapa jenis obat-obatan, vaksin, bahan pangan, bahan pakaian dan lainnya telah diproduksi dengan memanfaatkan teknologi DNA Rekombinan. Halaman 2 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Dalam kehidupan kita sehari-hari, secara langsung maupun tidak langsung, sebagian dari kita pernah berhubungan dengan hasil penggunaan teknologi DNA Rekombinan. Contoh insulin telah digunakan untuk mengobati penyakit diabetes. Penyakit diabetes pada manusia diobati dengan insulin manusia. Bagaimanakah kita dapat memperoleh insulin manusia ini ?. Apakah untuk mengobati orang yang sakit diabetes ini kita harus mengorbankan orang yang sehat untuk diekstrak insulinnya ?. Tentu saja tidak. Saat ini insulin manusia telah berhasil diproduksi secara masal dengan menggunakan bakteri. Kemampuan bakteri untuk memproduksi insulin manusia ini adalah karena manusia telah berhasil memasukkan dan mengintegrasikan gen yang menyandikan insulin manusia kedalam genom bakteri. Contoh lainnya adalah kapas transgenik. Kapas transgenik pernah ramai dibicarakan di media masa kita pada awal abad 21 ini. Salah satu kapas transgenik adalah kapas-bt. Tanaman kapas-bt telah mengandung gen penyandi toksin yang berasal dari bakteri Bacillus turingiensis Bt. Toksin tersebut dapat membunuh hama kapas sehingga kapas-bt tersebut tahan terhadap serangan hama. Tanaman kapas ini tahan terhadap serangan hama ulat karena tanaman ini menghasilkan toksin yang dapat membunuh hamanya ulat. Toksin tersebut disandikan oleh gen yang berasal dari bakteri Bacillus turingiensis Genom tanaman kapas ini mengandung gen yang berasal dari bakteri Bacillus turingiensis. Oleh karena itu, tanaman kapas ini seringkali disebut sebagai kapas-Bt Bt = Bacillus turingiensis. Kapas-bt merupakan salah satu contoh organisme transgenik. Organisme transgenik adalah organisme yang mengandung gen yang berasal dari jenis organisme lainnya. Oleh karena tanaman kapas ini mengandung gen yang asalnya dari organisme lainnya, maka kapas ini secara umum disebut tanaman kapas transgenik. Bakteri penghasil insulin dan tanaman kapas-bt tersebut merupakan sebagian dari hasil rekayasa yang dilakukan manusia terhadap makhluk hidup dengan menggunakan teknologi DNA rekombinan. Halaman 3 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Teknologi DNA rekombinan berdasarkan pada mekanisme yang terdapat pada bakteri. Hasil Percobaan Lederberg dan Tatum 1946 menunjukkan bahwa bakteri mempunyai mekanisme seksual. Mekanisme seksual pada bakteri ini menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang berbeda. Mekanisme seksual pada bakteri ini merupakan pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel lainnya. Jadi mekanisme seksual pada bakteri ini tidak bersifat reproduktif tidak menghasilkan anak atau zuriat. Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga cara yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri sehingga terbentuk kromosom rekombinan. Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel sel donor ke dalam sel bakteri lainnya sel resipien melalui kontak fisik antara kedua sel. Sel donor sel jantan memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel resipien sel betina. Transfer DNA ini melalui pili seks yang dimiliki oleh sel jantan. Sel betina tidak memiliki pili seks. DNA dari sel jantan berpindah ke dalam sel betina secara replikatif. Oleh karena itu, setelah proses konjugasi selesai, sel jantan tidak kehilangan DNA. Setelah konjugasi selesai kedua sel berpisah kembali dan jumlah sel tidak bertambah setelah konjugasi tidak dihasilkan anak sel. Oleh karena itu, proses konjugasi ini disebut juga sebagai proses atau mekanisme seksual yang tidak reproduktif. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri DNA asing dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri lainnya atau dari organisme lainnya. Masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri ini dapat terjadi secara alami. Fenomena transformasi ini telah diamati oleh Griffith 1928 dan kelompok Avery 1944. Griffith 1928 telah menemukan bahwa strain bakteri yang tidak virulen strain yang penampilan koloninya kasar dapat berubah sifatnya menjadi strain yang virulen penampilan koloninya halus. Perubahan sifat ini disebabkan karena strain yang tidak virulen strain kasar dicampur dengan sel-sel bakteri strain virulen strain halus yang telah dimatikan. Halaman 4 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Avery, McCleod, dan McCarty 1944 menemukan bahwa perubahan sifat atau transformasi dari bakteri kasar menjadi menjadi bakteri halus atau perubahan dari tidak virulen menjadi virulen tersebut disebabkan oleh adanya DNA dari sel bakteri halus yang masuk ke dalam sel bakteri kasar. Berdasarkan pada mekanisme transformasi alami ini, kita dapat melakukan transformasi bakteri secara buatan. Dengan perlakuan tertentu, kita dapat memasukkan potongan DNA ke dalam sel bakteri. Prinsipnya sederhana yaitu mencampurkan sel-sel bakteri hidup dengan potongan DNA tertentu di dalam tabung reaksi. Beberapa waktu kemudian kita dapat menyeleksi selsel bakteri yang sudah mengandung potongan DNA tertentu tersebut. Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya melalui perantaraan fage. Beberapa jenis virus berkembang biak di dalam sel bakteri. Virus-virus yang inangnya adalah bakteri seringkali disebut bakteriofage atau fage. Pada waktu fage menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA-nya ke dalam bakteri. DNA fage ini kemudian bereplikasi di dalam sel bakteri atau berintegrasi dengan kromosom bakteri ingat siklus hidup fage siklus litik dan siklus lisogenik. Pada waktu DNA fage dikemas di dalam pembungkusnya untuk membentuk partikel fage-fage baru, DNA fage tersebut dapat membawa sebagian dari DNA bakteri yang telah menjadi inangnya. Selanjutnya bila fage menginfeksi bakteri lainnya, maka fage akan memasukkan DNA-nya yang mengandung sebagian dari DNA bakteri inangnya yang sebelumnya. Dengan demikian, fage tidak hanya memasukkan DNA-nya sendiri kedalam sel bakteri yang diserangnya tetapi juga memasukkan DNA dari sel bakteri lainnya yang ikut terbawa pada DNA fage. Jadi, secara alami fage memindahkan DNA dari satu sel bakteri ke sel bakteri lainnya. Perangkat yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah perangkat-perangkat yang ada pada bakteri. Perangkat tersebut antara lain adalah enzim restriksi, enzim DNA ligase, plasmid, transposon, pustaka genom, enzim transkripsi balik, pelacak DNA/RNA. Halaman 5 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Enzim restriksi digunakan untuk memotong DNA. Pada tahun 1960, Werner Arber & Hamilton Smith menemukan enzim dari mikroba yang dapat memotong DNA utas ganda. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan nama enzim restriksi atau endonuklease restriksi. Enzim tersebut mengenal dan memotong DNA pada sekuens spesifik yang panjangnya 4 sampai dengan 6 pasang basa. Enzim tersebut sekarang dikenal dengan nama enzim restriksi atau enzim endonuklease restriksi. Secara alami, bakteri menghasilkan enzim restriksi untuk menghancurkan DNA fage yang menginfeksinya yang masuk ke dalam sel bakteri. Sampai saat ini sudah banyak jenis enzim restriksi yang telah ditemukan dan diisolasi dari berbagai spesies bakteri. Nama setiap enzim restriksi diawali dengan tiga huruf yang menyatakan nama bakteri yang menghasilkan enzim tersebut. Setiap enzim restriksi mengenal sekuens dan situs pemotongan yang khas. Enzim restriksi memotong DNA bukan pada sembarang tempat, tetapi memotong DNA pada bagian tertentu. Bagian pada DNA yang dikenai aksi pemotongan oleh enzim restriksi ini dinamakan sekuens pengenal. Suatu sekuens pengenal adalah urutan nukleotida urutan basa tertentu yang dikenal oleh enzim restriksi sebagai tempat atau bagian yang akan dipotongnya. Salah satu contoh enzim restriksi ini adalah enzim EcoRI yang telah diisolasi pertama kali oleh Herbert Boyer pada tahun 1969 dari bakteri Escherichia coli. Enzim EcoRI memotong DNA pada bagian yang urutan basanya adalah GAATTC sekuens pengenal bagi EcoRI adalah GAATTC. Di dalam sekuens pengenal tersebut, enzim EcoRI memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara G dan A. Pada DNA utas ganda, sekuens GAATTC ini akan berpasangan dengan sekuens yang sama tetapi berlawanan arah. Enzim EcoRI ini memotong setiap utas dari utas ganda tersebut pada bagian antara G dan A. Sebagai akibatnya, potongan-potongan atau fragmen-fragmen DNA utas ganda yang dihasilkan akan memiliki ujung berutas tunggal. Ujung seperi ini yang dikenal dengan istilah sticky ends atau cohesive ends. Halaman 6 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Enzim DNA ligase digunakan untuk menyambung DNA. Pada tahun 1972, David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg melaporkan bahwa mereka berhasil membuat molekul DNA rekombinan. Mereka berhasil menggabungkan fragmen-fragmen DNA dengan cara memasangkan anneal ujung sticky ends dari satu fragmen dengan ujung sticky ends fragmen lainnya, kemudian menyambungkan kedua ujung fragmen-fragmen tersebut secara kovalen dengan menggunakan enzim DNA ligase. Keberhasilan membuat DNA rekombinan ini terjadi tidak lama setelah enzim restriksi ditemukan dan diisolasi pertama kali dari oleh Herbert Boyer yaitu pada tahun 1969 . Plasmid digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen atau mengklonkan fragmen DNA atau mengubah sifat bakteri. Pada umumnya bakteri mempunyai satu kromosom. Kromosom bakteri berupa DNA sirkular atau DNA yang berbentuk lingkaran. Disamping memiliki satu kromosom, berbagai jenis bakteri juga memiliki DNA sirkular lainnya yang ukurannya jauh lebih kecil dari pada DNA kromosomnya. DNA sirkuler selain kromosom yang terdapat pada bakteri dinamakan plasmid. Jadi, plasmid merupakan DNA bakteri yang terpisah dari kromosom bakteri. Plasmid dapat bereplikasi sendiri. Plasmid juga mengandung berbagai gen. Jenis, jumlah jenis, dan jumlah tiap jenis copy plasmid bervariasi antar sel. Bahkan antar sel dalam satu spesies bakteri. Plasmid mulai digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen tidak lama setelah David Jackson, Robert Simon, dan Paul Berg berhasil membuat molekul DNA rekombinan itu pada tahun 1972. Dalam hal ini, plasmid digunakan sebagai pembawa fragmen DNA asing. Dengan kata lain, plasmid dikombinasikan dengan DNA asing. Plasmid rekombinan yang pertama kali berhasil bereplikasi di dalam sel bakteri adalah plasmid pSC101 yang telah dikonstruksi oleh Stanley Cohen dan Herbert Boyer SC=Stanley Cohen. Salah satu contoh plasmid yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklon gen adalah plasmid pBR322. Plasmid pBR322 ini mengandung gen penyandi resistensi terhadap ampisilin dan tetrasiklin. Pada gambar disamping ditujukkan adanya berbagai situs yang dapat dipotong oleh enzim restriksi. Halaman 7 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Adanya gen resistensi terhadap antibiotik yang didalamnya mengandung situs enzim restriksi akan memberikan kemudahan dalam menyeleksi plamid rekombinan atau memudahkan dalam menyeleksi klon bakteri yang telah membawa plasmid rekombinan. Akan lebih memudahkan lagi dengan adanya enzim yang hanya memotong pada bagian gen resistensi terhadap antibiotik. Misalnya, enzim PstI yang hanya akan memotong pBR322 pada bagian gen resistensi terhadap ampisilin gen ApR. Dari beberapa perangkat diatas enzim restriksi, enzim DNA ligase, dan plasmid, telah memungkinkan bagi kita untuk mengklonkan gen atau fragmen DNA. Dalam hal ini, kita dapat membuat plasmid rekombinan plasmid yang mengandung fragmen DNA asing di dalam tabung reaksi. Bila dikombinasikan dengan salah satu cara bakteri memindahkan DNA, yaitu transformasi, kita dapat memasukkan plasmid rekombinan tersebut ke dalam sel bakteri. Tahapan dalam mengklonkan gen meliputi pemotongan plasmid, menyisipkan gen atau fragmen DNA, memasukkan DNA kedalam sel bakteri trasformasi, seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Pemotongan plasmid. Plasmid pBR322 dipotong di dalam tabung reaksi menggunakan enzim restriksi PstI maka pBR322 akan terpotong atau terbuka pada bagian gen ApR. Menyisipkan gen atau fragmen DNA. Bila pBR322 yang sudah terbuka lingkarannya dicampur dengan potongan DNA asing dan kemudian ditambahkan enzim DNA ligase, maka kemungkinan hasilnya adalah berupa campuran yang berisi 1 plasmid pBR322 yang tersambung kembali atau membentuk lingkaran lagi seperti semula, 2 plasmid rekombinan yaitu pBR322 yang telah disisipi oleh DNA asing. Halaman 8 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Memasukkan DNA kedalam sel bakteri trasformasi. Campuran kedua bentuk plasmid ini kemudian dicampurkan dengan kumpulan sel-sel bakteri hidup yang tidak mempunyai plasmid. Kemungkinan hasilnya berupa campuran yang berisi 1 sel bakteri yang mendapatkan plasmid pBR322 tanpa sisipan, 2 sel yang mendapatkan plasmid rekombinan pBR322 yang telah disisipi DNA asing, 3 sel bakteri yang tidak mengandung tidak dimasuki plasmid. Seleksi klon bakteri yang benar yaitu bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Dalam contoh ini, seleksi dilakukan dengan menggunakan media tumbuh bakteri yang mengandung antibiotik. Sel yang yang tidak mengandung pasmid tidak akan tumbuh pada media yang mengandung ampisilin maupun tetrasiklin. Sel bakteri yang mengandung plasmid tanpa sisipan pBR322 semula tumbuh pada media yang mengandung tetrasiklin maupun ampisilin. Sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan tumbuh pada media yang mengandung tetrasiklin tetapi tidak tumbuh pada media yang mengandung ampisilin karena gen ApR disisipi DNA asing sehingga sehingga tidak berfungsi. Dalam teknis pelaksanaannya, cairan suspensi dalam pekerjaan transformasi campuran antara bakteri, plasmid, dan DNA asing yang telah diperlakukan dalam rangka transformasi disebarkan pada media yang mengandung tetasiklin. Koloni bakteri yang tumbuh adalah koloni Sel1 dan koloni Sel2 koloni adalah kumpulan sel yang sama yang semula berasal dari satu sel. Sel bakteri yang tidak mengandung plasmid tidak mampu tumbuh. Masing-masing koloni yang tumbuh pada media+tetrasiklin kemudian dipindahkan pada media+ampisilin. Koloni yang tidak tumbuh pada media+ampisilin adalah koloni yang diinginkan sel-sel bakterinya mengandung plasmid rekombinan. Contoh plasmid lainnya yang telah lama digunakan sebagai vektor untuk mengklonkan gen adalah plasmid pUC118 dan pUC119. Plasmid ini merupakan pengembangan dari pBR322. Plasmid pUC118 dan pUC119 mengandung gen lacZ yang menyandikan enzim b-galactosidase. Pada lacZ terdapat daerah yang disebut daerah polikloning. Halaman 9 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Pada daerah polikloning ini terdapat banyak situs restriksi dari berbagai enzim restriksi. Dalam hal ini, kita dapat menggunakan berbagai enzim restriksi untuk memotong pUC118 atau pUC119 pada bagian lacZ. Dengan demikian kita dapat menyisipkan DNA asing pada bagian lacZ. Bila gen lacZ disisipi oleh DNA asing maka gen lacZ tersebut tidak berfungsi tidak menghasilkan β-galactosidase. Bila kita menggunakan pUC188 atau pUC119 sebagai plasmid vektor, maka koloni yang membawa plasmid rekombinan dapat dideteksi dengan menggunakan Xgal 5-bromo-4-chloroindolyl-β-D-galactosida. Enzim β-galactosidase akan memecah Xgal menjadi galatosa dan 5-bromo-4-chloroindigo berwarna biru. Koloni bakteri yang mengandung plasmid pUC118 atau pUC119 akan berwarna biru bila ditumbuhkan pada media yang mengandung Xgal. Hal ini karena l bakteri menghasilkan enzim β-galactosidase. Oleh karena medianya mengandung Xgal maka enzim β-galactosidase memecahkan Xgal sehingga dihasilkan 5-bromo-4-chloroindigo yang berwarna biru. Koloni bakteri akan berwarna putih bila pUC118 atau pUC119 telah disisipi DNA asing pada bagian lacZ. Dalam hal ini sel bakteri tidak menghasilkan enzim β-galactosidase karena gen lacZ. Gen lacZ tidak berfungsi karena disisipi oleh DNA asing. Transposon digunakan sebagai alat untuk melakukan mutagenesis dan untuk menyisipkan penanda. Keberhasilan para ahli dalam melakukan rekayasa genetika terhadap berbagai organisme tidak lepas dari peranan transposon. Transposon atau elemen loncat mula-mula ditemukan oleh Barbara McClintock. Untuk sampai pada penemuan tentang adanya transposon, Barbara McClintock mempelajari penyebab terjadinya variasi warna biji jagung. Seperti yang pernah anda pelajari sebelumnya bahwa biji jagung terbentuk sebagai hasil dari pembuahan ganda dua pembuahan. Satu pembuahan menghasilkan zigot yang kemudian berkembang menjadi embrio yang tersimpan dalam biji jagung. Satu pembuahan lainnya menghasilkan endosperma. Endosperma inilah yang kita lihat penampilannya yang nampak sebagai biji jagung. Endosperma ini merupakan bagian terbesar dari biji dan merupakan bagian penyimpan makanan. Endosperma inilah yang kita gunakan kandungan karbohidratnya untuk makanan kita maupun makanan ternak. Halaman 10 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Oleh karena endosperma ini awalnya berasal dari satu sel sel triploid yang merupakan hasil peleburan antara satu initi sel sperma dengan dua inti sel kutub yang kemudian membelah secara mitosis. Oleh karena itu seharusnya endosperma tersebut merupakan kumpulan sel yang sama sifatnya. Bila kumpulan sel endosperma warnanya sama maka setiap titik pada permukaan setiap biji jagung itu warnanya sama atau seragam. Bila berwarna putih, maka seluruh permukaan biji jagung endospermanya berwarna putih. Atau bila kuning, maka seluruh permukaan biji jagung endospermanya berwarna kuning. Oleh karena itu, anda apat menemukan di pasar atau di penjual sayur keliling, jagung yang setiap bijinya berwarna kuning atau putih. Barbara McClintock mempelajari mengapa ada biji jagung yang warnanya tidak seragam sehingga nampak kuning dengan bercak-bercak coklat. Pola bercaknya tidak teratur. Biji yang satu dengan biji lainnya juga berbeda pola bercaknya. Dengan melakukan persilangan-persilangan antar tanaman jagung yang berbeda warna bijinya, akhirnya Barbara McClintock menemukan bahwa ketidak-seragaman atau variasi warna biji jagung disebabkan oleh adanya bagian dari kromosom yang berpindah-pindah. Bagian dari kromosom tersebut pindah dari satu tempat ke tempat lain pada kromosom yang sama atau pindah dari satu kromosom ke kromosom lainnya. Bagian dari kromosom yang dapat berpindah tempat tersebut dinamakan transposon. Jadi, transposon adalah DNA yang dengan sendirinya dapat berpindah-pindah tempat atau berpindah posisinya. Transposon dapat berpindah-pindah tempatnya pada satu molekul DNA atau pada satu krosom. Transposon juga dapat pindah dari satu molekul DNA ke molekul DNA lainnya atau pindah dari satu kromosom ke kromosom lainnya. Karena memiliki kemampuan untuk berpindah tempat dengan sendirinya maka sering kali transposon disebut juga dengan nama elemen loncat. Transposon dapat ditemukan pada berbagai jenis tanaman, cendawan, dan bakteri. Jenis transposon bermacam-macam berdasarkan ukuran atau panjangnya, gen-gen yang dikandungnya, dan cara berpindahnya. Transposon yang paling sederhana hanya mengandung gen penyandi enzim tranposom transposase. Enzim transposon ini dibutuhkan untuk melepaskan diri dari tempat semula dan menyisip ke tempat lain. Transposon yang lebih kompleks dapat mengandung satu atau beberapa gen tertentu misalnya gen-gen penyandi resistensi terhadap antibiotik. Halaman 11 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Bila transposon menyisip pada suatu gen tertentu maka gen tertentu tersebut akan terganggu fungsinya. Oleh karena itu, transposon sering digunakan oleh para peneliti untuk melakukan mutagenesis melakukan proses mutasi sehingga dihasilkan mutan. Misalnya, untuk mempelajari gen yang menyebabkan warna hijau, seorang peneliti dapat menggunakan transposon untuk mendapatkan mutan yang tidak berwarna hijau. Mutan menjadi tidak hijau karena gen penentu warna hijau disisipi oleh transposon. Dengan melacak posisi dimana transposon berada maka peneliti tersebut dapat mempelajari gen yang menentukan warna hijau karena gen tersebut telah disisipi transposon gen warna hijau bersatu bersama transposon. Transposon juga dapat digunakan untuk menandai suatu sel. Transposon yang membawa gen resistensi terhadap antibiotik sering digunakan oleh para peneliti sebagai penanda. Kita dapat menandai suatu strain bakteri dengan menyisipkan gen resistensi terhadap suatu antibiotik. Untuk menyisipkan gen resistensi terhadap antibiotik, kita dapat menggunakan transposon. Misalnya, kita dapat menandai strain bakteri-B dengan menggunakan transposon Tn5-kanR transposon Tn5 yang mengandung gen kanR. Gen kanR menyandikan resistensi terhadap antibiotik kanamisin. Kita dapat menggunakan Tn5-kanR untuk menandai agar bakteri-B menjadi resisten terhadap kanamisin. Bila Tn5 masuk ke dalam sel bakteri-B maka Tn5 beserta gen kanR yang dikandungnya akan menyisip ke dalam DNA kromosom bakteri-B. Dengan demikian bakteri-B yang semula tidak tahan terhadap kanamisin, setelah disisipi Tn5 menjadi tahan terhadap kanamisin. Selanjutnya bila sel bakteri-B yang sudah ditandai tersebut tercampur dengan sel bakteri lainnya, maka kita masih dapat memilihnya atau menyeleksinya yaitu menggunakan media yang mengandung kanamisin. Dalam hal ini, bakteri lain tidak tumbuh, sedangkan bakteri-B yang sudah ditandai dapat tumbuh pada media dengan antibiotik kanamisin tersebut. Transposon dapat digunakan untuk menandai sel, menandai suatu gen, melacak keberadaan suatu gen, menemukan letak suatu gen di dalam kromosom. Jadi, transposon merupakan salah satu perangkat penting di dalam teknologi DNA rekombinan. Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Halaman 12 Pustaka Genom digunakan untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang telah diklonkan. Salah satu cara yang digunakan untuk mempelajari genom suatu organisme adalah dengan menggunakan pendekatan Shot-Gun. Dengan pendekatan ini, DNA total dipotong menggunakan enzim restriksi. Oleh karena jumlah potongannya sangat banyak maka sangatlah sulit untuk mempelajari setiap potongan tersebut dalam waktu yang bersamaan. Oleh karena itu, potongan-potongan tersebut perlu untuk disimpan lebih dulu sebelum mendapatkan gilirannya untuk dipelajari. Untuk menyimpan potongan atau fragmen DNA genom digunakan Pustaka Genom. Pustaka genom merupakan koleksi berbagai klon bakteri yang berisi plasmid rekombinan maupun koleksi klon fage yang mengandung DNA rekombinan. Di dalam pustaka genom ini, setiap plasmid rekombinan atau setiap DNA fage rekombinan membawa salah satu potongan atau fragmen DNA genom yang dipelajari. Setiap klon bakteri membawa satu plasmid rekombinan sedangkan setiap klon fage membawa satu DNA fage rekombinan. Kumpulan klon-klon bakteri yang membawa plasmid rekombinan ini dinamakan Pustaka Plasmid, sedangkan kumpulan fage rekombinan dinamakan Pustaka Fage. Jadi Pustaka Genom dapat berupa Pustaka Plasmid dan/atau Pustaka Fage. Enzim traskripsi balik digunakan untuk membuat DNA berdasarkan RNA. Tidak lama setelah penemuan enzim restriksi, Howard Temin dan David Baltimore secara terpisah pada tahun 1970 menemukan enzim transkripsi-balik reverse-transcriptase yang digunakan oleh retrovirus untuk membuat copy DNA berdasarkan RNA-nya. Enzim transkripsi-balik ini kemudian digunakan untuk mengkonstruksi copy DNA yang disebut cDNA complementary DNA dengan menggunakan RNA sebagai cetakannya. Dengan demikian gen atau bagian dari gen dapat disintesis berdasarkan mRNA. Proses sintesis DNA dengan cara ini merupakan kebalikan dari pada proses transkripsi. Oleh karena itu dinamakan transkripsi balik. Halaman 13 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Saat ini, enzim transkriptase-balik sudah diproduksi secara komersial. Ketersediaan enzim transkriptase-balik ini telah memberikan kemudahan bagi para peneliti untuk mempelajari gen yang bertanggung-jawab terhadap sifat-sifat tertentu. Tanpa enzim transkriptase-balik, pekerjaan mencari gen umumnya dimulai dari mengisolasi DNA total genom, kemudian memotongmotongnya menjadi ratusan ribu potongan yang kemudian diteruskan dengan mempelajari setiap potongan. Cara ini tentu saja membutuhkan lebih banyak tenaga dan memakan waktu yang lebih lama. Dengan ketersediaan enzim transkritase-balik, pekerjaan mencari gen tidak lagi harus dimulai dengan mengisolasi DNA genom total tetapi dimulai dengan mengisolasi mRNA. Tahapan utama dalam pembuatan DNA menggunakan transkriptase balik ini adalah sebagai berikut 1 DNA gen eukariot terdiri atas intron dan exon, pada wakttu transkripsi semua bagian tersebut diterjemahkan oleh enzim transkriptase menjadi RNA. 2 Dalam proses pasca-transkripsi, intron dibuang sehingga mRNA tidak lagi mengandung intron. 3 Bila kita berhasil mengisolasi mRNA dari sel, maka kita dapat membuat DNA gen yaitu dengan menambahkan enzim transkriptase-balik. 4 Enzim transkriptase-balik mensisntesis DNA dengan menggunakan mRNA tersebut sebagai cetakannya. Hasilnya berupa DNA utas tunggal. 5 Setelah dihasilkan DNA utas tunggal, DNA polimerase akan mensintesis utas DNA pasangannya sehingga dihasilkan gen yang berupa DNA utas ganda. DNA gen hasil dari transkripsi balik ini tidak mengandung intron. Pelacak DNA / RNA digunakan untuk mendeteksi gen atau fragmen DNA yang diinginkan atau untuk mendeteksi klon yang benar. Edwin M Southern, pada tahun 1975, telah mempublikasikan prosedur untuk mendeteksi fragmen DNA yang spesifik. Prosedur ini dikenal dengan nama teknik Southern Blotting. Pelacak atau probe yang digunakan untuk mengidentifikasi fragmen DNA yang spesifik tersebut merupakan asam nukleat pendek, berutas tunggal RNA atau DNA berutas tunggal dan diberi label radioaktif atau non radioaktif. Halaman 14 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Bila dicampurkan dengan fragmen-fragmen DNA, rangkaian basa yang ada pada probe tersebut akan berpasangan dengan rangkaian basa komplementer yang ada pada fragmen DNA. Dengan kata lain bahwa fragmen DNA yang akan tertempeli probe adalah fragmen DNA yang mengandung urutan basa yang komplementer dengan urutan basa pada probe. Dengan teknik ini, gen tertentu dapat diisolasi dari campuran fragmen DNA yang kompleks. Langkah awalnya adalah memisahkan fragmenfragmen DNA dengan cara elektroforesis pada gel agarosa. Fragmen DNA yang telah terpisah di dalam gel agarose, selanjutnya didenaturasi dibuat menjadi utas tunggal. Fragmen-fragmen DNA tersebut kemudian ditransfer pada filter nitroselulosa atau membran nilon sehingga setiap fragmen DNA menempel kuat pada membran dan posisinya yang sama dengan posisi pada gel agarosa. Kemudian membran atau filter direndam dalam cairan yang mengandung probe. Bila probe-nya adalah probe radioaktif, filter selanjutnya ditempelkan atau diekspose pada lembaran film X-ray untuk mengetahui posisi fragmen yang tertempeli probe pada filter atau membran. Probe non-radioaktif juga telah cukup lama dikembangkan. Probe dapat dikaitkan dengan enzim, misalnya peroksidase sehingga menjadi probeenzim. Deteksinya dapat dilakukan dengan menggunakan substrat chemiluminescent yang signalnya ditangkap oleh lembaran film x-ray. Probe juga dapat dikaitkan dengan vitamin misalnya biotin, sedangkan deteksinya menggunakan enzim misalnya alkalin phosphatase. Signalnya akan nampak langsung pada filter atau membran berupa pita-pita yang berwarna biru/ungu bila pita-pita tersebut merupakan fragmen DNA yang berikatan dengan probe. Dengan prinsip yang sama yaitu perpasangan basa-basa probe dengan basa-basa DNA target yang komplementer, probe asam nukleat ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi klon yang benar. Klon DNA gen atau fragmen DNA dapat dibuat melalui pembuatan plasmid rekombinan di dalam tabung reaksi mencampurkan plasmid asal dan fragmen DNA. Kemungkinan yang dapat ditemui di dalam tabung reaksi tersebut adalah plasmid tanpa mengandung fragmen DNA plasmid asal dan plasmid rekombinan plasmid yang mengandung fragmen DNA. Halaman 15 Home - Reproduksi Sel - Hereditas - Struktur Gen - Regulasi Ekspresi Gen –Teknologi DNA - Genom Manusia Tahap berikutnya adalah memasukkan plasmid ke dalam sel bakteri dengan cara mencampurkan campuran plasmid tersebut dengan bakteri inangnya. Kemungkinan yang dapat terjadi dalam hal ini adalah ada sel bakteri yang tidak berisi plasmid, ada sel yang berisi plasmid asal, dan ada sel yang berisi plasmid rekombinan. Teknik Southern Blotting tersebut di atas dapat digunakan untuk mendeteksi klon yang benar klon bakteri yang mengandung plasmid rekombinan, yaitu dengan menggunakan probe yang spesifik untuk fragmen DNA yang diklonkan urutan basanya komplemen dengan urutan basa pada fragmen yang diklonkan. Berdasarkan mekanisme bakteri, perangkat bakteri, dan beberapa teknik diatas, DNA rekombinan dapat dibuat paling tidak melalui tiga pendekatan, yaitu 1 Mengestraksi DNA total suatu organisme, memotong DNA total menjadi fragmen-fragmen, memilih fragmen yang dikehendaki, mengklonkan fragmen yang telah terpilih. 2 Mengestraksi DNA total suatu organisme, memotong DNA total menjadi fragmen-fragmen, mengklonkan semua fragmen DNA pada vektor yang sesuai, menguji setiap klon untuk mendapatkan gen yang diinginkan. 3 Sintesis gen atau fragmen DNA yang diinginkan secara langsung dan mengklonkan gen atau fragmen DNA hasil sintesis. Halaman 16

seorang peneliti melakukan penelitian menggunakan teknologi dna rekombinan